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蛋白測定提純定氮儀操作步驟

更新時間:2017-07-26      瀏覽次數:2002

蛋白測定提純定氮儀操作步驟 概述

蛋白質的測定方法,目前仍以1883年凱達爾氏(Kiedahl)發明的定氮法為基礎,它根據各種蛋白質都具有固定比數的氮這一事實,通過對氮的測定而推算出蛋白質含量,此法所得的含氮量除了確定屬于蛋白質組成成分的氮以外,還包括非蛋白質組成的其他有機及無機態氮,所以換算所得的蛋白質含量稱作為粗蛋白含量,一般蛋白質中的含量為18%,換算后即每6.25克蛋白質中含有1克氮,因此6.25成為換算系數K,但是不同的農產品及其制品的實際含氮量有區別,所以不同農產品必須采用不同的換算系數,如花生、大豆、蠶豆、大麥、小麥、燕麥、黑麥等含氮為17.6%,求得K=5.7,蕎麥、葵花籽、亞麻籽、籽、棉花籽、蓖麻籽等換算系數則為K=5.50,玉米、菜籽為6.00,水稻為5.95,上述以外的其他農產品的換算系數均適用6.25。盡管如此,目前世界上還沒有直接分離測定含蛋白質的可行方法。因此,迄今為止在國內外凱氏定氮法仍然是測定蛋白質含量的經典方法。所得結果準確、穩定。

我公司研制生產的KDN系列定氮儀(蛋白質測定儀),是引進消化吸收國內外檢測新技術,結合我國國情,應用凱氏定氮法原理,采用化學與物理學相結合完成的成套蛋白質含量快速測定裝置。為糧食、食品、飼料、農業、商檢等檢測部門提供了理想的檢測設備。

二、 工作原理

KDN系列定氮儀檢測原理為:

整套裝置,由電加熱消化器、蒸餾器兩部分組成。要提高蛋白質含量測定的檢測速度,其關鍵是要加速樣品消化煮解的時間(40分鐘左右),KDN系列定氮儀消化裝置采用井式電加熱爐,增大了消化管受熱面,使消化管連同管內所注入的10ml H2SO4及試樣置入消化管插入井式爐內加熱取得更佳的熱效應,在消化前置入硒片作為催化劑進一步加速消化煮解,大大縮短消化時間。消化管內溢出的SO2等有害氣體,通過消化管上的排污管經抽吸泵由水帶入下水道,有效的抑制有害氣體的外逸,由省略了實驗室中安裝毒氣通風櫥,試樣經40分鐘左右消化煮解,即可*消化。

消化的過程主要反應如下:

R•C•H•NH2•COOH (蛋白質)+ H2SO4 → CO2 + SO2 + NH3 + H2O

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

蒸餾與吸收過程的主要反應如下:

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

NH3 + 4H3BO3 → NH4HB3O7 + 5H2O

 

然后經滴定,計算蛋白質含量,滴定的過程是鹽酸和硼酸氫銨反映的過程。

NH4HB3O7 + HCl + 5H2O → NH4Cl + 4 H3BO3

三、 技術參數

1. 測定品種:糧食、食品、飼料、釀造、土壤、制糖、乳制品、藥物等物質

2. 測定范圍:含氮量0.05%~90% ( 0.1~200mg)

3. 測定數量:消化:一次同時消化個數按爐孔數定;單個蒸餾

4. 測定時間:消化每批45min;蒸餾每個6min

5. 測定重現性:平行試驗結果符合GB/T 6423-94

6. 電源:220V,50Hz

四、 使用說明

1. 其他儀器和用具

1.1分析天平:感量0.0001g

1.2實驗室用粉碎機或研缽

1.3酸式滴定管:25ml或10ml

1.4錐形瓶:容積250ml

1.5分樣篩:孔徑0.45mm(40目)

2.試劑

2.1鹽酸(HCl):分析純(GB622) 0.05mol/L標準液,(4.2ml鹽酸,注入1000ml蒸餾水)碳酸鈉法標定鹽酸。

2.2氫氧化鈉(NaOH):化學純或工業純(GB629)、40g溶于蒸餾水中溶成100ml,配成40%水溶液(m/v)。

2.3硼酸(H3BO3):分析純(GB628)2g,溶于蒸餾水中配成100ml 2%水溶液(m/v).

2.4混合指示劑:甲基紅(G5H15N3O2)(HG3-958)溶于乙醇配成0.1%乙醇溶液,溴甲酚綠(HG3-1220)溶于乙醇配成0.5%乙醇溶液,二種溶液等體積混合,陰涼處保存(保存期三個月以內)。

2.5硫酸銅(CuSO4•5H2O)分析純(GB655)10g;硫酸鉀(K2SO4) (HG3-920)分析純150g,在研缽中研磨,仔細混勻后過40目篩(加速劑)。(催化劑可以代替有毒的硒)

2.6濃硫酸(H2SO4)化學純(GB625)(含量98%、無氮)。

3.操作方法

3.1樣品消化

稱取經粉碎通過40-60目/寸試樣0.5-1g(視含量而定)無損的置入已洗滌烘干的試管中加催化劑一片和10ml硫酸。

將消化管分別放入消化架各個孔內,然后置于消化爐上,開啟抽吸泵水閥,使抽吸泵處于吸氣狀態。接通電源,再加熱初始階段需注意觀測,防止試樣因急沸而飛濺。(初化時,電壓調至150V左右溫度不宜太高。)

3.2蒸餾

KDN系列蒸餾器蒸餾時,堿液及蒸餾水采用電磁泵加液置入方法,因而避免了活塞中漏液現象,NaOH、H2O注入接口,橡膠管套入后分別置入NaOH、H2O盛器桶內,加液時按面板上相應開關,液體經電磁泵自動流入消化管內注入毫升數視標尺所注位置而定。

1.蒸餾器預熱:打開自來水,夾緊排水管、蒸汽開關,同時打開黃色進水開關待電流打開表指針指示在2A-3A時馬上關閉黃色進水開關,待蒸汽管噴出氣后打開黃色進水開關,半分鐘后電流表穩定在3.5-時關閉蒸汽開關,這一步只在剛開機時預熱。

2.在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示劑,并使接收瓶托盤往上移動。

3.扳動蒸餾托盤架把消化管固定在蒸餾器托盤上,然后按面板上H2¬O、NaOH開關,分別向消化管內注入蒸餾水和氫氧化鈉溶液,然后開啟蒸汽開關,向試管內注入蒸汽,進行蒸餾,在接收液在150ml左右時移下接收瓶,用蒸餾水沖洗出氣口繼續蒸餾半分鐘,然后取下接收瓶,待滴定用。其他消化好樣品可重復這一步進行蒸餾即可,不再需要預熱。

3.3滴定

用標定后的鹽酸溶液進行滴定接收瓶內的溶液,滴定溶液由綠色變為淡紫色為終點,記下消耗鹽酸溶液的毫升數,按下式計算蛋白含量:

蛋白含量(%)=式中:V2—滴定試樣時消耗酸標準溶液的體積 (ml)

      V1—滴定空白時消耗酸標準溶液的體積 (ml)

      C—標準酸溶液的摩爾濃度

      0.014—氮的毫克當量數

      K—氮換算成粗蛋白質的系數

      W—試樣重量 (g)

(空白測定:用0.1克糖代替樣品或不加樣品做空白測定)

平行測定的結果用算術平均值表示,保留小數后二位。

3.4 換算系數

結果報告中必須注明氮換算成粗蛋白質的系數,換算系數見下表。

樣品名稱 換算系數 數據來源

小麥 5.70 GB2905

大麥 5.70 GB2905

釀酒大麥 6.25 TOCT10846

面粉 5.70 GB5009.5

面包 5.70 AOAC14.103

大豆 6.25 GB2905

5.71 GB5009.5

玉米 6.25 食品常用數據手冊

6.24 GB5009.5

飼料 6.25 GB6432

肉制品 6.25 GB5009.5

乳制品 6.38 GB5009.5

牛奶 6.38 ACAC16.036

芝麻 5.30 GB5009.5

油菜 5.53 油菜籽綜合利用

3.5注意事項

1.消化時若有氣體外溢,加大抽吸泵水的流速。

2.NaOH溶液因長期不用,管內容易產生粘固現象,每天工作完畢把NaOH外接皮管,一如蒸餾水瓶內,抽洗幾次,待下一次使用時,在蒸餾時需排出100mlNaOH,以防稀釋NaOH。

3.每次試樣蒸餾結束,必須迅速取下消化管,防止消化管液體倒吸至蒸發爐內腐蝕電極板。

4.用戶在遵守本儀器的運輸、貯存、安裝、調整和使用規程的條件下,如發現儀器因制造質量問題而不能正常工作時,從收獲之日起一年內實行三包;或開箱時發現包裝不良而發生損壞,附件與裝箱單不符,短缺零件等情況,請與我公司質檢部門。來函注明產品型號、編號和出廠日期。本儀器使用時,要求用戶嚴格按照說明誰規定進行,如有疑問或對結構改進的意見,請來函告知我公司質檢部門。

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